microRNA實(shí)驗(yàn)方法

一、概觀miRNA

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小RNA分子，通過與靶RNA的3′UTR互補(bǔ)或部分互補(bǔ)結(jié)合，使其降解或介導(dǎo)其翻譯抑制，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。miRNAs及其衍生物在疾病診斷和治療有很大的前景。 miRNAs基因通常位于基因間或編碼蛋白基因的內(nèi)含子中，在核內(nèi)由RNA聚合酶II或III轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有特征性莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，然后在Drosha-DGCR8復(fù)合體的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA，它由exportin5由核內(nèi)運(yùn)到胞漿。在胞漿內(nèi)，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟雙鏈miRNA，其中的一條鏈與RISC結(jié)合而參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

miRBase數(shù)據(jù)庫第21版里列有來自223物種的28645莖環(huán)結(jié)構(gòu)和35828成熟miRNAs。可能近90%的人類基因受到miRNAs調(diào)控，然而，當(dāng)過表達(dá)或抑制某一個(gè)miRNA時(shí)，在發(fā)生調(diào)變的眾多基因當(dāng)中尋找并鑒定其中起關(guān)鍵作用的靶基因仍然具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。目前鑒定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，結(jié)合基因芯片分析以及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法來研究miRNA的功能及尋找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜來尋找miRNA靶基因也成為一種新的途徑。

二、miRNA的檢測(cè)和定量

為了驗(yàn)證miRNA在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，目前常用來檢測(cè)miRNA的技術(shù)主要有以下幾種：Northern雜交，原位雜交， Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT－PCR。這三種技術(shù)各有利弊，可以相互結(jié)合應(yīng)用，來反映細(xì)胞內(nèi)miRNA的真實(shí)表達(dá)水平。

Northern雜交

MicroRNA是一類很小的分子，部分microRNA表達(dá)水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究有一定困難，特別是重復(fù)性較差，步驟繁瑣等。目前多數(shù)研究人員采用Northern Blot，它是一種重復(fù)性好、靈敏高、直接的方法,可以用來檢測(cè)microRNA的存在、表達(dá)量的變化等。而由于放射污染等原因，同位素標(biāo)記的探針的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的鎖核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探針，具有穩(wěn)定性高、特異性好、無放射污染等優(yōu)點(diǎn)，成為新的Northern Blot檢測(cè)探針。

Northern雜交表明從人類和小鼠來的前miR-499和成熟miR-499條帶

基本原理

將待檢測(cè)的RNA分子變性后，通過尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,繼而按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，固定后再與同位素、地高辛或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。

用途

檢測(cè)樣品中的RNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

實(shí)驗(yàn)過程

1.提前配制無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠的混合液，即50ml of Pre-Gels：

Urea: 24 g

40% Acrylamide: 18.75 mL

5x TBE Buffer: 10 mL

ddH20: 0 mL

2.器皿的清洗：器皿同Western Blotting裝置。

用清水沖洗干凈，乙醇擦干3%；

H2O2 填充浸泡電泳槽、玻璃片、梳子10分鐘；

用0.1% DEPC處理過的水沖洗電泳槽，梳子和玻璃片。

用RNAase Away 擦海綿和其他相關(guān)器材。

安裝配膠裝置。

3.配膠：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混勻，加入玻片中，加入10或15齒梳子。大約30-60 min 即可凝好。

4.RNA樣品的準(zhǔn)備 Small RNAs（大約107細(xì)胞） （或者Total RNA ~20-200ug） 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加熱 5min, 冰上冷卻。 瞬時(shí)離心收集RNA樣品。

5.電泳：（裝置同Western Blotting電泳裝置），電泳液1xTBE。15% Urea-PAGE 在電泳液 1xTBE進(jìn)行電泳。電壓180V 直到溴芬蘭到達(dá)膠的底部。根據(jù)Ambion公司的步驟，在上樣之前，300V 預(yù)電泳10min（防止膠漏同時(shí)活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。選用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作為對(duì)照，同時(shí)將自己合成的RNA Oligo作為陽性對(duì)照（總量為1 pmol即可）。其中 溴芬蘭的對(duì)應(yīng)的分子量為13nt左右，二甲苯青FF對(duì)應(yīng)的為40 nt左右。

6.轉(zhuǎn)膜（裝置同Western Blotting轉(zhuǎn)膜裝置），轉(zhuǎn)膜液為0.5ⅹTBE。